MIKROBIOLOGIYA TADQIQOTLARINING ASOSIY METODLARI Reja: 1. Mikroorganizmlar bilan ishlashda rioya qilinadigan aseptika qoidalari 2. Laboratoriyada foydalanadigan elektr va boshqa asbob – uskunalar bilan ishlashni xavfsizligi ta’minlanadi. MBR-I mikroskopining tuzilishi 3. Laboratoriya ishlarini bajarishda talabalar qanday xolatda ish boshlashlari tuShuntiriladi 4. Fiksirlangan bo’yalgan preparat tayyorlash Tirik mikroorganizmlar populyatsiyasiga bakteriya kulturasi deyiladi. Laboratoriyada mikroorganizm kulturalari turli shaklda o’stiriladi (suyuq oziqa muxitlarida, agarli "qiyshiq agar” (“kosyak") larda (sterillangan agarli oziqa muhit ma’lum burchak ostida qiyshaytirilib qotiriladi), Petri likopchalaridagi qattik oziqa muxitlarida). Mikroorganizmlar kulturasi faqat bir turdan iborat bo’lsa u sof kultura deyiladi. Mikrobiologlar deyarli hamma vaqt sof bakteriya kulturalari bilan ish olib boradilar. Agar kultura bittadan ortiq mikroorganizmlar turini tutsa, u kultura aralash yoki iflos kultura deyiladi. Shuning uchun sof kulturalarning tozaligini saqlash mikrobiologlarning asosiy vazifalariga kiradi. Aks holda tadqiqodlarda olingan natijalar noto’g’ri bo’ladi. Mikroorganizmlarning atrof muhitda keng tarkalganligi tufayli ularning sof kulturalarga tushmasligini ta’minlash uchun muhofaza choralarini ko’rish muhim, ya’ni aseptika texnikasiga amal qilish lozim. Demak, aseptika texnikasiga ko’ra, mikroorganizmlar sterillangan oziqa muxitida o’stiriladi va bu muxitni atrofdan mikrorganizmlar tushishidan muhofaza qiliinadi. Sof kultura oziqa muxitga ekilganda quyidagi aseptika texnikasi qoidalariga amal kilinadi: 1) sof kulturaga tegishi mumkin bo’lgan barcha buyumlar oldindan sterillanadi; 2)ozikli muxit sterillanadi; 3) ekish va qayta ekish vaktlarida kultura ifloslanishidan saklanishi uchun extiyot qilinadi. Buning uchun quyidagi choralar amalga oshiriladi: a) barcha idish va oziqli muhitlar tayyor bo’lishi bilan darxol sterillanadi; b) havodagi mikroblar tushmasligi uchun oziqli muxitlar yopiq idishlarda saqlanadi. Bunda paxta va dokadan tayyorlangan tiqinlardan foydalaniladi va ular faqat ekish vaktida olib turiladi, lekin hech qachon stol yoki boshqa buyumlarga qo’yilmaydi; v) sterillangan idishlarni ichki va ulardagi steril oziqli muhitlarga hamda sof kulturalarga tegishi mumkin bo’lgan barcha vositalar avvaldan sterillanadi, masalan, bakteriologik ilmok; g) ekish va kayta ekish vaqtida ishlatiladigan probirka va kolbalarni og’zi ishdan oldin flambirlanadi va iloji boricha kam vakt davomida ochiq holda qoldiriladi: d) ish joyini mikroorganizmlar bilan ifloslanishdan saqlanadi, bakterial ilmoqlar ishlatilgandan so’ng ham sterillanadi, pipetkalar esa dezinfeksiya qiladigan suyuqliklarga solinib ko’yiladi. Laboratoriya sharoitida probirkadagi suyuq muhitdan boshqa probirkadagi muhitga ekish yoki Petri likopchasidagi agarli qattiq muhitga ekish kabi ishlar tez- tez amalga oshirilib turadi. Talabalar bunday mashg’ulotlarni bajarib, aseptika texnikasi qoidalarini amalda ko’llashni o’rganishlari lozim. Probirkadan probirkaga ekishda quyidagi ishlar bajariladi: 1. Mum qalam yordamida ekiladigan probirkalarga talabaning ismi, guruhini raqam soni yoziladi. 2. Ilmoq alanganing yuqori qismida cho’g’ holatigacha flambirlanadi va 10 daqiqa davomida sovutiladi, lekin stolga qo’yilmaydi. 3.Chap qo’l bilan kulturali probirka olinadi va ilmoq ushlagan qo’lni bo’sh barmoqlari bilan probirkani tiqini olinadi, lekin tiqin stolga qo’yilmay ushlab turiladi. Probirkaning og’zi alangada qisqa vaqt qizdiriladi. 1-rasm 2-rasm 3-rasm 4-rasm 5-rasm 4. Ilmoqdan foydalanib probirkadagi suyuqlikdan olinadi, bunda ilmoq probirkaning ichki tomoniga tegmasligi kerak. 5. Probirkani og’zi va tiqini alangada qizdirilib, probirka yopiladi va shtativga qayta qo’yiladi. 6.Bo’sh qo’l bilan ekiladigan probirka olinadi va yuqoridagidek ochilib, og’zi sterillash uchun qizdiriladi. 7. Ilmoqdagi suyuq kultura probirkaga asta solinadi so’ng aralashtiriladi. 8. Ilmoqdagi tomchilarni probirkani ichida qoldirish uchun ilmoq probirkani ichidagi suyuqlik tugagan joyiga tegiziladi. 9. Ilmoq asta chiqariladi va probirkani og’zi bilan tiqin flambirlanadi, probirka yopiladi va shtativga qo’yiladi. 10. Ilmoq cho’g’ holatigacha qizdiriladi. Probikadan Petri likopchasiga ekishda qo’yidagi ishlar amalga oshiriladi: 1. Petri likopchasining ustiga mum qalam yordamida talabaning ismi, guruhining raqam soni, sana yoziladi. 2. Yuqorida aytilganday, probirkadan ilmok bilan kultura solinadi. 3. Bo’sh qo’l bilan Petri likopchasining qopqog’i ochiladi, lekin stolga qo’yilmaydi va likopcha ustida ushlab turiladi. 4. Petri likopchasidagi oziqli muhitga ilmoqdagi kultura "shtrix" usulida ekiladi. Bunda agarni o’ymasdan extiyot qilib ekish lozim. 5. Petri likopchasi yopiladi. 6. Ilmoq flambirlanadi va joyiga qo’yiladi.Ekmalar 28 gradus0C da keyingi darsgacha o’stiriladi. 6-rasm 1) yorug’lik va elektron mikroskoplprning bakterialarning tadqiq qilishdagi roli. 2) prokariotlarning mikroskop ostida kuzatish: a) fiksirlangan, bo’yalgan preporat tayorlash. b) ezilgan tomchi usulida bakteriya preparatlarni tayorlash. v) bakterialarni boyitilgan va sof kulturalarini tayyorlash. g) sterilizatsiya usullari. Osma tomchi preparat tayyorlash uchun o’rtasida chuqurchasi bo’lgan maxsus toza buyum oynasi olinib, chuqurcha chetlariga vazelin surtiladi. Tozalangan qoplag’ich oyna o’ng qo’lga olinadi va spirt alangasi ustidan 2-3 marta o’tkaziladi, ya’ni sterillanadi. Chap qo’lga bakteriolgik ilmoqni olib, cho’g’ bo’lguncha spirt alangasi ustiga tutib turiladi. Ilmoqni sovitib, u bilan tekshirilayotgan mikroorganizmlar suspenziyasidan bir tomchi olib qoplag’ich oyna ustiga tomiziladi. Qoplag’ich oynadagi tekshirilayotgan material tomchisi buyum oynasi chuqurchasining markazida qoladigan qilib, ustiga buyum oynasi yopiladi. Buyum oynasi ohista siqib bosiladi va tezgina ag’dariladi. Preparat to’g’ri tayyorlangan bo’lsa, tomchi chuqurchada bemalol osilib turadi. Vazelin uni qurib qolishdan saqlaydi. Osma tomchi preparatdan mikroorganizmlarni tirik holida kuzatish uchun foydalaniladi. Ezilgan tomchi preparatini tayyorlash uchun esa buyum oynachasiga bir tomchi suyuqlik tomiziladi. Suyuqlik quvur suvi (bakteriyalar bilan ishlanganda) yoki etil spirti va glitserinning bir xil hajmdagi aralashmasi (mikroskopik zamburug’lar bilan ishlanganda) bo’lishi mumkin. Tomchi ustiga tekshirilishi kerak bo’lgan mikroorganizmlar kiritilib aralashtiriladi va qoplag’ich oynani sekingina tomchi ustiga qoplanadi. Qoplag’ich oyna atrofidan chiqqan ortiqcha suyuqlikni filtr qog’ozga shimdirib olinadi. Qattiq oziq muhitiga o’stirilgan bvkteriyalarning tomchisini bakterial ilmoq yordamida, mikroskopik zamburug’larni bir-biriga bog’langan ikki igna yordamida, suyuq muhitda o’stirilgan mikroorganizmlarni esa tomizgich yordamida buyum oynasiga qo’yiladi. Suyuq muhitdan olingan mikroorganizmlardan foydalanib preparat tayyorlanganida suyuqlik ishlatilmaydi. Suyuq muhitni quyidagicha tayyorlash mumkin: 20-25 g quruq pichanni maydalab 200 ml suvga botiriladi va 30oli termostatda 2-3 kun saqlanadi. Mikroorganizmlar neytral sharoit-da yaxshi rivojlanishini nazarda tutib, unga ozgina bo’r qo’shiladi. Tirik hujayralarni bo’yash. Hujayralar ba’zi xususiyatlarini va ulardagi qo’shilmalarni aniqlash uchun mikroorganizmlar tirik holda bo’yash usulidan foydalaniladi. Bo’yoq moddalarning zaxarliligini hisobga olgan xolda, tirik hujayralar neytral qizil, neytral binafsha, metilen ko’ki, fuksin, eozin va eritrozinlarning juda kam miqdordagi (0,001-0,0001%) kontsentratsiyalari bilan bo’yaladi. O’rganilayotgan mikroorganizmlar tomchisi buyum oynasida bo’yoq aralashmasi tomchisi bilan aralashtiriladi, qoplagich oyna bilan yopiladi va 2-3 minutdan so’ng mikroskopda ko’riladi. Mikroorganizmlarning tabiiy shakli, kattaligi va tuzilishi, ularning ayrim tuzilmalari (hujayradan tashqaridagi shilimshiqlar) to’g’risidagi tushunchalarni negativ preparatlar beradi. Negativ bo’yash uchun suyuq tushь, qizil kongoning 3% li suvli eritmasi, nitrozinning 10% li eritmasi va mikrob hujayralariga singmaydigan boshqa bo’yoqlar ishlatiladi. Tush yoki boshqa bo’yoq eritmasini tomchisi o’rganilayotgan kulьtura tomchisi bilan aralashtiriladi, ustidan qoplagich oyna bilan yopiladi. Bo’yoqlar hujayrani o’rab turgan bo’shliqni to’ldiradi. Natijada bo’yalmagan mikroorganizmlar preparatning to’q fonida yaxshi yoritilgan rangsiz kamsulalar ko’rinishida aniq ajralib turadi. Negativ bo’yash boshqacha tarzda amalga oshirilishi ham mumkin. Buyum oynasiga qizil kongoning 3% li suvdagi eritmasininig tomchisi tomiladi. Bu tomchiga o’rganilayotgan material qo’shiladi va sal aralashtiriladi. Shundan keyin hosil bo’lgan aralashma ilmoq yordamida spiral ko’rinishida yoyiladi. Bunda ilmoq har gal yangi joydan olib o’tiladi. Material qon surtmasi tayyorlash jarayonidagi singari qoplag’ich oyna bilan ham yopilishi mumkin. Surtma havoda quritiladi, fiksirlanmaydi va immersion ob’ektiv bilan mikroskopda ko’riladi. Qizil-jigarrang fonda mikroorganizmlarning bo’yalmagan shakllari yaxshi ko’rinadi. Fiksatsiya qilingan mikroorganizmlar preperatlarini tayyorlash. Yashash jarayoni to’xtatilgan, lekin nozik tuzilmalari to’liq saqlangan mikroorganizmlar hujayralari fiksatsiya qilingan hisoblanadi. Fiksatsiya qilingan bo’yalgan hujayralar va ularning tuzilish detallari preparatda yaqqol ajralib turadi. Bu hujayralarning shakli va ichki elementlarini o’rganishni yengillashtiradi. Fiksatsiya qilingan preparatlar odatda immertsiya orqali ko’rinadi. Fiksatsiya qilingan bo’yalgan preparatlarni tayyorlash quyidagi bosqichlarni o’z ichiga oladi: surtmani tayyorlash, quritish, fiksatsiya qilish va uni bo’yash. Surtmani tayyorlash. Surtmalar yog’sizlantirilgan toza buyum oynalarda tayyorlanadi. Buyum oynasi pintset yordamida yoki ikki chetidan barmoqlar bilan ushlagan xolda olinadi va gorelka alangasiga tutib sal kuydiriladi. Shundan keyin kuydirilgan tomonini tepaga qaratib vannacha ustidagi ko’prikchaga (rezina shlang parchalari bilan tutashtirilgan ikkita shisha tayoqcha) qo’yiladi. “Ezilgan tomchi” preparati tayyorlanadi, ilmoq yordamida yaxshilab aralashtiriladi va hosil bo’lgan suspenziya yupqa tekis qatlam ko’rinishida 1-2 sm maydonga yoyiladi. Surtmani quritish. Surtma xona haroratida quritiladi. Agar quritish jarayoni sekin kechsa, surtma tepaga qaratilgan preparat gorelka alangasi ustida balandroq ko’tariladi va oynani qizdirmasdan iliq havoda quritiladi. Aks xolda hujayralar shakli buzilishi mumkin. Fiksatsiya qilish. Fiksatsiya qilish jarayoni mikroorganizm hujayralari o’ldiriladi va havfsizlantiriladi. Bu esa patogen kulьturalar bilan ishlashga muhim ahamiyatga ega. Fiksatsiya qilish natijasida hujayralar oynaga jips yopishib qoladi va keyingi jarayonlarda tushib ketmaydi. O’lik hujayralar bo’yoqni o’ziga yaxshi singdiradi, yaьni yaxshi bo’yaladi. Fiksatsiya qilish uchun preparat pintset yordamida yoki bosh va ko’rsatkich barmoqlar bilan ushlanadi va gorelka alangasi ustidan 3-4 olib o’tiladi. Buyum oynasi barmoq tekkizilganda sal kuydiradigan darajada 2-3 sekund mobaynida qizdiriladi. Bundan ortiq termik fiksatsiya mikrob hujayralarining tuzilishi va shaklini o’zgartirib yuborishi mumkin. Shuningdek, kimyoviy moddalar bilan fiksatsiya qilish ham qo’llaniladi. Buning uchun surtmali buyum oynasi 96% li etonol solingan menzurkaga 15-20 min, suvsiz metanolga 3-5 min, atsetonga 5 min, Nikiforov aralashmasiga 15-20 min, etanol va 40% li formalinning 95:5 nisbatdagi aralashmasiga 2 minut solib qo’yiladi. Fiksatorni bevosita surtma ustiga qo’yish va ko’rsatilgan vaqtgacha tutib turish ham mumkin. Fiksatsiya tugagandan keyin surtma distillangan suv oqimi bilan yuviladi va shundan keyin bo’yaladi. Bo’yash. Mikroorganizmlarni bo’yashning oddiy, murakkab va differentsial usullari mavjud. Oddiy bo’yash usulida bitta bo’yoq ishlatiladi va barcha hujayralar bo’yaladi. Murakkab bo’yash usulida ikki yoki bir nechta bo’yoqlardan foydalanish ko’zda tutiladi. Masalan, bakteriyalarning Gram bo’yicha bo’yashga munosabatini diagnostik aniqlash. Differentsial bo’yash usuli hujayra biologik tuzilmalarining turli bo’yoqlarga nisbatan individual munosabatiga asoslangan (sporalarni, qobiqni, xivchinlarni, yadroni, kapsulani va h.k ni bo’yash). Fiksatordan yuvilgan surtma vannacha ustiga o’rnatilgan ko’prikchaga joylashtiriladi. Surtma ustiga bo’yoq eritmasi tomizg’ich bilan quyiladi. Bo’yash davomiyligi har xil bo’ladi: suvli fuksin uchun – 1-2 min, ko’k metilen uchun – 3-5 min. Bo’yash jarayoni tugagandan keyin preparat oynaning chetidan ushlagan xolda olinadi, qiya xolatda tutiladi va kuchsiz suv oqimi yordamida bo’yoq yuvib tashlanadi. Yuvish oqib tushayotgan suvda bo’yoq deyarli qolmagunga qadar davom ettiriladi. Shundan keyin preparat havoda yoki oynaga ehtiyotlik bilan filtr qog’ozini tegizib quritiladi. Bo’yalgan surtma immertsion ob’ektiv orqali mikroskopda ko’riladi. Puxta tayyorlangan va to’g’ri bo’yalgan preparatda ko’rish maydoni toza bo’lib, faqat hujayralar bo’yalgan bo’ladi xolos. Toza fon hosil qilish uchun byoq eritmasini surtma ustiga qo’yilgan filtr qog’ozga qo’yish yoki oldindan tegishli bo’yoq singdirilgan filtr qog’ozdan foydalanish mumkin. Fiksatsiya qilingan surtma ustiga bir necha distillangan suv tomchisi tomiziladi, uning ustidan esa surtma o’lchamiga moslab qirqib olingan va tegishli bo’yoq bilan bo’yalgan filtr qog’oz qo’yiladi, u oyna sirtiga bosiladi va belgilangan muddatda shunday ushlab turiladi. Shundan keyin qog’oz olib tashlanadi, preparat suv bilan yuviladi, quritiladi va immertsiya orqali mikroskopda ko’riladi. Elektron mikroskopni yaratilishi bilan oddiy yorug’lik mikroskoplar ham o’z mavqeini yo’qotgani yo’q. Hozirgi zamon mikroskoplari 2000–2500 ga qadar kattalashtirib berganligi uchun turli ayrim bakteriyalarning morfologiyasini oson aniqlanadigan bo’ldi. Eng kattalashtirish 90x15 immersion ob’ekt qobiliyati deyiladi. Uni ko’paytirish va ozaytirish ikki usulda qilinadi. 1. Eng katta operturali ob’ektlardan foydalanish. Bu esa har bir ob’ektivga yozilgan. Eng katta operturali ob’ektiv bu MI–90 yoki OI–90, bundan morfologlar foydalaniladigan ob’ektivlar hisoblanadi. 2. Ikkinchi usuli esa ob’ektga kelayotgan nurni to’lqin uzunligini qisqartirish. Bunda ultrabinafsha nurlardan foydalaniladi. Buning uchun maxsus moslama UF mikroskopidan foydalaniladi. Ya’ni nurni to’lqin uzunligi 1/3 ga qisqartiradi. Bu degani oddiy yorug’lik mikroskopida 0.2–0.3 mkm kattalikga ega bo’lgan mikroorganizmlarni ko’rish mumkin. Biologik mikroskoplar yordamida har tomonlama o’rganish uchun mikroorganizmlarni fiksatsiyalab bo’yash orqali erishiladi. Mikroorganizmlarni tirik holida o’rganish uchun mikroskopga turli moslamalar o’rnatilib o’rganiladi. Biz shulardan Koller yorug’ligini xususiyati va undan foydalanish usullaridan birini ko’rib chiqamiz. Koller yorug’ligi. 1. Hozirgi zamon biologik mikroskoplarni to’la imkoniyatdan foydalanish uchun Koller usulida yoritishdan foydalanish kerak. 2. Yoritgich OI–19 yoki OI–9 ni mikroskop oldida o’rnatish uchun shotivga maxkamlanib mikroskop va yoritgich orqali bir xil masofada bo’lishi kerak. Yoritkichni burab mikroskop oynasini o’rtasiga tushuriladi. 3. Mikroskop kondensatori to’la tepaga ko’tarilib uni diafragmasi to’la berkitiladi. 4. Maydon diafragmasini yoritgich maydon diafragmasi 1,0 – 1,2 sm diametrli qilib olinadi. 5. Yoritgich lampasini burab uzoq yaqinlashtirish bilan oynadagi speralni aniq ko’rinishiga olib keladi. Buning uchun yorug’lik tushayotgan oynaga oq qog’oz qo’yib to’g’rilab olinadi. 6. Mikroskopni oynasidagi yorug’likni ko’rish maydoniga to’g’rilab olinadi. Zarurat tug’ilganda yorug’lik kuchini transformator yordamida pasaytirib kuchaytirish mumkin. 7. Mikrokopni buyum stolchasiga preparatni joylashtirib kichik ob’ektiv orqali yorug’likni aniq yo’nalishini topib oladi. 8. Mikroskop oynasini burash yordamida ko’rish maydonini diafragma yoritgichga to’g’rilab moslanadi. 9. Mikroskopni immersion ob’ektividan foydalanish usullari. Hozirgi zamon mikroskoplari ichida o’quvchilarga moslangan qulay mikroskop markalaridan MBI–1; MBI–3; va biolama modeli hisoblanadi. Mikroskopni qimmatini oshiradigan qismi bu uni ob’ektivi hisoblanadi. Ob’ektiv xususiyatlarini bilish uchun quyidagi tomonlarini eslatib o’tamiz: ob’ektivlar quruq va moyli guruhga bo’linadi. Quruq ob’ektivlar (8x40x) bunda uncha katta bo’lmagan ob’ektlar ko’rinib 400–600 marta kattalashgan. Bunda preparat va ob’ektiv oralig’ida havo qatlami bo’ladi. Mikroskopni buyum oynasi va havoni yorug’lik singdirish xususiyatlari har xil bo’lganidan yorug’lik kuzatuvchini ko’ziga to’g’ridan–to’g’ri tushmaydi. Mikroorganizmlar morfologiyasini va xususiyatini o’rganishda doimo immertsion ob’ektivdan (90x) foydalaniladi, 950 dan 1350 martagacha kattalashtirib beradi.